말초 혈액 세포로부터 순환 종양 세포를 지속적으로 분리하기 위한 새로운 통합 미세유체 칩 설계

Scientific Reports 12권, 기사 번호: 17016(2022) 이 기사 인용

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암은 전 세계적으로 사망 원인 1위 중 하나입니다. 후기 단계의 발표, 접근하기 어려운 진단 및 치료는 선진국에서 흔히 발생하는 과제입니다. 순환종양세포(CTC)를 조기에 발견하고 계수하는 것이 보다 효과적인 치료로 이어질 수 있다고 합니다. 말초 혈액에 존재할 가능성이 낮기 때문에 초기 단계에서 CTC를 분리하는 것은 어렵습니다. 본 연구에서는 유체역학적 관성 집중 및 유전 영동 분리를 기반으로 하는 새로운 2단계, 라벨 없는 신속하고 연속적인 CTC 분리 장치를 제안합니다. 곡선형 미세유체 채널 내부의 벽 유도 관성 양력과 딘 항력의 우세와 미분은 CTC와 백혈구(9- 12.2μm). 곡선형 마이크로채널에서 유체역학적 관성 포커싱 메커니즘을 조사하기 위해 수치 모델이 사용되었습니다. 제안된 설계에서 매개변수의 최적화된 값을 선택하기 위해 RBC, 혈소판, CTC 및 백혈구(4가지 주요 하위 유형)를 사용하여 시뮬레이션을 수행했습니다. 첫 번째 단계에서는 미세 세포의 초점 거동을 연구하여 적혈구 및 혈소판에서 백혈구와 순환종양세포를 분류했으며, 두 번째 단계에서는 유전영동을 사용하여 고유한 전기적 특성을 기반으로 생존 가능한 순환종양세포를 백혈구에서 분리했습니다. 제안된 장치 설계는 수치 시뮬레이션을 사용하여 CTC 분리 효율을 평가했습니다. 본 연구에서는 종횡비, 유전영동력, 채널 크기, 유속, 분리 효율 및 모양과 같은 중요한 요소가 세포 분리에 미치는 영향을 고려했습니다. 결과는 제안된 장치가 12.2 ml/h의 처리량으로 99.5% 분리 효율로 실행 가능한 CTC를 생성한다는 것을 보여줍니다.

세계보건기구(WHO)와 글로벌 암 관측소(Global Cancer Observatory)에 따르면, 2040년까지 연간 신규 암 발병 건수는 2,950만 명, 암 관련 사망자 수는 1,640만 명으로 증가할 것으로 예상됩니다1,2. 대부분의 경우 암은 종양 세포가 몸 전체로 전이될 때까지 진단 및 치료되지 않습니다3. 그 후 환자는 생존율이 거의 없이 곧 재발합니다. 순환종양세포(CTC)는 원발성 종양, 재발 또는 전이에서 떨어져 나와 말초혈액을 순환하며 항원성 및 유전적 종양 특이적 특징을 지닌 세포입니다4. CTC는 전이라고 불리는 신체의 다른 부위에서 종양의 2차 성장을 일으킬 수 있습니다4. CTC는 뚜렷한 형태학적, 분자적 특성을 가지고 있습니다. 그들은 종양 발달의 매우 초기 단계에서 전혈로 나타나기 시작합니다5. CTC의 계정을 유지함으로써 질병 진단, 모니터링 및 맞춤형 암 치료를 수행할 수 있는 것으로 밝혀졌습니다6. 이러한 사실을 고려할 때, 효과적인 치료를 위해 질병을 조기에 진단하려면 희귀한 순환종양세포(비침습적 표지자)를 발견하고 평가하는 것이 필수적입니다7. 전혈에서 CTC를 계산하는 것은 암 초기 단계의 환자에서 부족하기 때문에 매우 어렵습니다. 즉, 다른 세포에 비해 1~10개 세포/ml8, 5 x 109/ml 적혈구, 2 x 108/ml 혈소판 및 1 x 106 백혈구9. 암 진행을 결정하기 위해 추가 하류 유전자형 및 표현형 분석을 위해서는 생존 가능한 CTC가 필요합니다. 암세포의 이질적인 형태로 인해 분리가 기술적으로 어려워집니다. 생존 가능한 CTC를 특성화하고 분리하려면 감도가 높은 세포 분류 장치가 필요합니다. 종종 "액체 생검"이라고 불리는 전혈에서 CTC를 검출하는 방법은 과학 및 임상계의 주목을 받고 있습니다11. 이 방법은 진단, 예후 및 치료 효능 평가에 대한 잠재력을 갖고 있기 때문입니다12. 현재까지 CTC13,14,15,16,17,18,19,20의 검출 및 분리를 위한 여러 가지 방법이 고안되었습니다. 분리 기술은 CTC를 전혈과 구별하는 생물리학적 특성을 활용합니다. 미세유체 세포 분류기는 진단 목적으로 가장 일반적으로 사용됩니다. 미세유체 기술은 미세채널의 유체 전달 과정을 조사하는 데 사용됩니다. 장점으로는 작은 샘플 크기, 짧은 반응 시간, 저렴한 비용 등이 있습니다. 동일한 기술을 기반으로 기능이 통합된 Lab-on-Chip(LOC) 장치가 생물학적 분석을 수행하기 위해 개발되었습니다21,22,23. 미세유체 세포 분류기는 활성 또는 수동으로 광범위하게 분류됩니다. 능동 기술은 전기, 자기, 광학, 음향, 생화학 등과 같은 외부 자극을 사용합니다.22. 수동 기술에서는 외부 힘이 가해지지 않고 크기, 모양, 채널 구조 및 유체 역학적 힘과 같은 본질적인 특성을 활용합니다. 일부 기술에서는 분리 전에 CTC 라벨링이 필요합니다24,25. 샘플은 형광 라벨링, 사전 염색, 부착 등과 같은 특정 세포 표면 마커를 사용하여 라벨링되어 분리 후 열거 및 시각화가 가능합니다. 연구원들의 초점은 CellSearch 시스템을 포함한 CTC 열거 및 탐지 방법 개발에 있었습니다. 예를 들어 EpCAM 또는 다양한 시토케라틴과 같은 상피 세포에 특이적인 면역 표지 기술을 사용하여 많은 노력이 이루어졌습니다. 그러나 EpCAM을 발현하지 않거나 상피에서 중간엽으로의 전환(EMT)4,26,27을 겪은 CTC를 잃을 위험이 있습니다.

> 1, inertial focusing of microparticles happens while when it become < < 1 the dean drag force mixes particles65,66. Equation 3 shows that inertial migration intensity depends on system parameters and that it is directly propotional to two times the cell size. Therefore, cells with large diameters tend to move toward the channel wall and achieve an equilibrium position somewhere between the wall and center. The cell/particle focusing by dominant inertial lift force is strongly dependent on the ratio ap /Dh where ap is the cell diameter64,67. In this ratio hydraulic diameter is an important factor due to change in channel height at the same condition of Reynold's number. According to our proposed approach and hypothesis, prior efficient separation of red blood cells and platelets (size ~ 2-4 µm) from the whole blood could facilitate the CTC isolation and recovery in DEP stage. From the findings of Lee et al.68, a CEA microchannel with low aspect ratio enable the separation of particles under 4 µm in diameter high flow rate and throughput. Therefore, we opted low aspect ratio of the contraction region of the inertial microfluidic channel. Considering the diameters of all the target cells, we initially designed different Curved-CEA microfluidic channels with low aspect ratio (AR = H/W) and channel height ranging from 40-100µ. We studied the behaviour of cell focusing by quantitatively exploring the effect of the modulation of the inertial force. The ap /Dh ratio of CTCs at an aspect ratio of 0.8–2 were calculated with 0.17–0.07, respectively./p> \varepsilon_{f}^{*}\), it is termed as positive DEP and it attracts the cells towards the electrodes. In contrast, negative DEP repels the cells or particles from the region of a high electric field./p>